Јавасцрипт је тренутно онемогућен у вашем претраживачу.Када је јавасцрипт онемогућен, неке функције ове веб странице неће радити.
Хавиер Фидалго, * Пјер-Антоан Деглесне, * Родриго Арроио, * Лилиан Сепулведа, * Евгенииа Раннева, Пхилиппе Депрез Департмент оф Сциенце, Скин Тецх Пхарма Гроуп, Цастелло Д'Емпуриес, Каталонија, Шпанија * Ови аутори имају неки увид у овај рад Екуал позадина доприноса: Хијалуронска киселина (ХА) је природни полисахарид који се користи у производњи дермалних филера у естетске сврхе.Пошто има полуживот од неколико дана у људским ткивима, дермални филери на бази ХА су хемијски модификовани како би се продужио њихов живот у телу.Најчешћа модификација у комерцијалним пунилима на бази ХА је употреба 1,4-бутандиол диглицидил етра (БДДЕ) као средства за умрежавање за умрежавање ланаца ХА.Заостали или неизреаговани БДДЕ се сматра нетоксичним са <2 дела на милион (ппм);стога, резидуални БДДЕ у коначном дермалном филеру мора бити квантификован како би се осигурала безбедност пацијента.Материјали и методе: Ова студија описује детекцију и карактеризацију нуспроизвода реакције унакрсног повезивања између БДДЕ и ХА у алкалним условима комбиновањем течне хроматографије и масене спектрометрије (ЛЦ-МС).Резултати: Након различитих анализа, откривено је да алкални услови и висока температура коришћени за дезинфекцију ХА-БДДЕ хидрогела подстичу формирање овог новог нуспроизвода, једињења налик пропилен гликолу.ЛЦ-МС анализа је потврдила да нуспроизвод има исту моноизотопску масу као БДДЕ, различито време задржавања (тР) и различиту УВ апсорбанцију (λ=200 нм).За разлику од БДДЕ, у ЛЦ-МС анализи је примећено да под истим условима мерења, овај нуспроизвод има већу стопу детекције на 200 нм.Закључак: Ови резултати указују да у структури овог новог једињења нема епоксида.Отворена је дискусија за процену ризика овог новог нуспроизвода који се налази у производњи ХА-БДДЕ хидрогела (ХА дермални филер) за комерцијалне сврхе.Кључне речи: хијалуронска киселина, ХА дермални филер, умрежена хијалуронска киселина, БДДЕ, ЛЦ-МС анализа, БДДЕ нуспроизвод.
Филери на бази хијалуронске киселине (ХА) су најчешћи и најпопуларнији дермални филери који се користе у козметичке сврхе.1 Овај дермални филер је хидрогел, обично састављен од >95% воде и 0,5-3% ХА, што им даје структуру налик гелу.2 ХА је полисахарид и главна компонента екстрацелуларног матрикса кичмењака.Један од састојака.Састоји се од (1,4)-глукуронске киселине-β (1,3)-Н-ацетилглукозамина (ГлцНАц) понављајућих дисахаридних јединица повезаних гликозидним везама.Овај дисахаридни образац је исти у свим организмима.У поређењу са неким филерима на бази протеина (као што је колаген), ово својство чини ХА високо биокомпатибилним молекулом.Ови пуниоци могу да испоље специфичност секвенце аминокиселина коју пацијентов имуни систем може препознати.
Када се користи као дермални филер, главно ограничење ХА је његов брзи обрт у ткивима због присуства специфичне породице ензима званих хијалуронидазе.До сада је описано неколико хемијских модификација у структури ХА како би се повећао полуживот ХА у ткивима.3 Већина ових модификација покушава да смањи приступ хијалуронидазе полисахаридним полимерима умрежавањем ХА ланаца.Због тога, због формирања мостова и интермолекуларних ковалентних веза између структуре ХА и агенса за умрежавање, умрежени ХА хидрогел производи више производа разградње анти-ензима него природни ХА.4-6
До сада, хемијска средства за умрежавање коришћена за производњу умреженог ХА укључују метакриламид, 7 хидразид, 8 карбодиимид, 9 дивинил сулфон, 1,4-бутандиол диглицидил етар (БДДЕ) и поли(етилен гликол) диглицидил етар.10,11 БДДЕ је тренутно најчешће коришћени агенс за умрежавање.Иако је деценијама доказано да су ове врсте хидрогелова безбедне, коришћени агенси за умрежавање су реактивни реагенси који могу бити цитотоксични и, у неким случајевима, мутагени.12 Због тога њихов резидуални садржај у финалном хидрогелу мора бити висок.БДДЕ се сматра безбедним када је резидуална концентрација мања од 2 дела на милион (ппм).4
Постоји неколико метода за откривање концентрације ниског остатка БДДЕ, степена умрежавања и положаја супституције у ХА хидрогеловима, као што су гасна хроматографија, хроматографија искључивања величине заједно са масеном спектрометријом (МС), методе мерења флуоресценције нуклеарне магнетне резонанце (НМР) и Течна хроматографија високих перформанси спојена са диодним низом (ХПЛЦ).13-17 Ова студија описује детекцију и карактеризацију нуспроизвода у коначном умреженом ХА хидрогелу произведеном реакцијом БДДЕ и ХА у алкалним условима.ХПЛЦ и течна хроматографија-масена спектрометрија (ЛЦ-МС анализа).Пошто је токсичност овог нуспроизвода БДДЕ непозната, препоручујемо да се квантификација његовог остатка одреди на сличан начин као и метод који се обично изводи на БДДЕ у финалном производу.
Добијена натријумова со ХА (Схисеидо Цо., Лтд., Токио, Јапан) има молекулску тежину од ~1.368.000 Да (Лорентова метода) 18 и својствени вискозитет од 2,20 м3/кг.За реакцију умрежавања, БДДЕ (≥95%) је купљен од Сигма-Алдрицх Цо. (Ст. Лоуис, МО, САД).физиолошки раствор са фосфатним пуфером са пХ 7,4 набављен је од компаније Сигма-Алдрицх.Сви растварачи, ацетонитрил и вода коришћени у ЛЦ-МС анализи су купљени од ХПЛЦ квалитета.Мравља киселина (98%) се купује као реагенс.
Сви експерименти су изведени на УПЛЦ Ацкуити систему (Ватерс, Милфорд, МА, УСА) и повезани на АПИ 3000 троструки квадруполни масени спектрометар опремљен са електроспреј јонизационим извором (АБ СЦИЕКС, Фрамингхам, МА, САД).
Синтеза умрежених ХА хидрогелова започета је додавањем 198 мг БДДЕ у 10% (в/в) раствор натријум хијалуроната (НаХА) у присуству 1% алкалије (натријум хидроксид, НаОХ).Коначна концентрација БДДЕ у реакционој смеши била је 9,9 мг/мЛ (0,049 мМ).Затим је реакциона смеша темељно измешана и хомогенизована и остављена да настави на 45°Ц током 4 сата.19 пХ реакције се одржава на ~12.
Након тога, реакциона смеша је испрана водом, а коначни ХА-БДДЕ хидрогел је филтриран и разблажен са ПБС пуфером да би се постигла концентрација ХА од 10 до 25 мг/мЛ, и коначни пХ од 7,4.Да би се произведени умрежени ХА хидрогелови стерилисали, сви ови хидрогелови се аутоклавирају (120°Ц 20 минута).Пречишћени БДДЕ-ХА хидрогел се чува на 4°Ц до анализе.
Да би се анализирао БДДЕ присутан у умреженом ХА производу, узорак од 240 мг је измерен и уведен у централну рупу (Мицроцон®; Мерцк Миллипоре, Биллерица, МА, САД; запремина 0,5 мЛ) и центрифугиран на 10.000 рпм на собној температури 10 минута.Сакупљено је и анализирано укупно 20 µЛ течности за спуштање.
Да би се анализирао БДДЕ стандард (Сигма-Алдрицх Цо) у алкалним условима (1%, 0,1% и 0,01% НаОХ), ако су испуњени следећи услови, течни узорак је 1:10, 1:100 или до 1:1,000,000 Ако је потребно, користите МиллиК дејонизовану воду за анализу.
За почетне материјале коришћене у реакцији унакрсног повезивања (ХА 2%, Х2О, 1% НаОХ и 0,049 мМ БДДЕ), 1 мЛ сваког узорка припремљеног од ових материјала је анализиран коришћењем истих услова анализе.
Да би се одредила специфичност пикова који се појављују у јонској мапи, 10 µЛ стандардног раствора БДДЕ од 100 ппб (Сигма-Алдрицх Цо) је додато узорку од 20 µЛ.У овом случају, коначна концентрација стандарда у сваком узорку је 37 ппб.
Прво припремите основни раствор БДДЕ са концентрацијом од 11.000 мг/Л (11.000 ппм) разблаживањем 10 μЛ стандардног БДДЕ (Сигма-Алдрицх Цо) са 990 μЛ МиллиК воде (густина 1,1 г/мЛ).Користите овај раствор за припрему раствора БДДЕ од 110 µг/Л (110 ппб) као средњег стандардног разблажења.Затим користите средњи БДДЕ стандардни разблаживач (110 ппб) да припремите стандардну криву разблаживањем међуразблаживача неколико пута да бисте постигли жељену концентрацију од 75, 50, 25, 10 и 1 ппб.Као што је приказано на слици 1, утврђено је да стандардна крива БДДЕ од 1,1 до 110 ппб има добру линеарност (Р2>0,99).Стандардна крива је поновљена у четири независна експеримента.
Слика 1 БДДЕ стандардна калибрациона крива добијена ЛЦ-МС анализом, у којој је уочена добра корелација (Р2>0,99).
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија.
Да би се идентификовали и квантификовали БДДЕ стандарди присутни у умреженој ХА и БДДЕ стандарди у основном раствору, коришћена је ЛЦ-МС анализа.
Хроматографско раздвајање је постигнуто на ЛУНА 2,5 µм Ц18(2)-ХСТ колони (50×2,0 мм2; Пхеноменек, Торранце, Калифорнија, САД) и држано на собној температури (25°Ц) током анализе.Мобилна фаза се састоји од ацетонитрила (растварач А) и воде (растварач Б) који садржи 0,1% мравље киселине.Мобилна фаза се елуира градијентом елуирања.Градијент је следећи: 0 минута, 2% А;1 минут, 2% А;6 минута, 98% А;7 минута, 98% А;7,1 минута, 2% А;10 минута, 2% А. Време рада је 10 минута, а запремина ињекције је 20 µЛ.Време задржавања БДДЕ је око 3,48 минута (у распону од 3,43 до 4,14 минута на основу експеримената).Мобилна фаза је пумпана при брзини протока од 0,25 мЛ/мин за ЛЦ-МС анализу.
За БДДЕ анализу и квантификацију помоћу МС, УПЛЦ систем (Воде) је комбинован са АПИ 3000 троструким квадруполним масеним спектрометром (АБ СЦИЕКС) опремљеним електроспреј јонизационим извором, а анализа се врши у режиму позитивних јона (ЕСИ+).
Према анализи јонских фрагмената обављеном на БДДЕ, за фрагмент највећег интензитета утврђено је да је фрагмент који одговара 129,1 Да (слика 6).Стога, у режиму праћења више јона (МИМ) за квантификацију, конверзија масе (однос масе и наелектрисања [м/з]) БДДЕ износи 203,3/129,1 Да.Такође користи режим потпуног скенирања (ФС) и режим скенирања јона производа (ПИС) за ЛЦ-МС анализу.
Да би се проверила специфичност методе, анализиран је слепи узорак (почетна мобилна фаза).Није детектован сигнал у празном узорку са конверзијом масе од 203,3/129,1 Да.Што се тиче поновљивости експеримента, анализирано је 10 стандардних ињекција од 55 ппб (у средини калибрационе криве), што је резултирало резидуалном стандардном девијацијом (РСД) <5% (подаци нису приказани).
Заостали садржај БДДЕ је квантификован у осам различитих аутоклавираних БДДЕ умрежених ХА хидрогелова, што одговара четири независна експеримента.Као што је описано у одељку „Материјали и методе“, квантификација се процењује просечном вредношћу регресионе криве стандардног разблажења БДДЕ, која одговара јединственом пику откривеном при транзицији масе БДДЕ од 203,3/129,1 Да, са задржавањем време од 3,43 до 4,14 минута Без чекања.Слика 2 приказује пример хроматограма референтног стандарда БДДЕ од 10 ппб.Табела 1 сумира резидуални садржај БДДЕ у осам различитих хидрогелова.Опсег вредности је од 1 до 2,46 ппб.Стога је резидуална концентрација БДДЕ у узорку прихватљива за људску употребу (<2 ппм).
Слика 2 Јонски хроматограм 10 ппб БДДЕ референтног стандарда (Сигма-Алдрицх Цо), МС (м/з) прелаз добијен ЛЦ-МС анализом од 203,30/129,10 Да (у позитивном МРМ режиму).
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција;МС, маса;м/з, однос масе и пуњења.
Напомена: Узорци 1-8 су аутоклавирани БДДЕ умрежени ХА хидрогелови.Преостала количина БДДЕ у хидрогелу и врхунац времена задржавања БДДЕ такође су пријављени.Коначно, пријављено је и постојање нових пикова са различитим временима задржавања.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ХА, хијалуронска киселина;МРМ, праћење вишеструких реакција;тР, време задржавања;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;РРТ, релативно време задржавања.
Изненађујуће, анализа ЛЦ-МС јонског хроматограма је показала да је на основу свих анализираних аутоклавираних узорака ХА хидрогела умреженог, постојао додатни пик при краћем времену задржавања од 2,73 до 3,29 минута.На пример, слика 3 приказује јонски хроматограм умреженог узорка ХА, где се додатни пик појављује у различитом времену задржавања од приближно 2,71 минута.Уочено релативно време задржавања (РРТ) између новоуоченог пика и пика из БДДЕ је 0,79 (Табела 1).Пошто знамо да се ново уочени пик мање задржава у колони Ц18 која се користи у ЛЦ-МС анализи, нови пик може одговарати поларнијем једињењу од БДДЕ.
Слика 3. Јонски хроматограм узорка умреженог ХА хидрогела добијеног помоћу ЛЦ-МС (МРМ конверзија масе 203,3/129,0 Да).
Скраћенице: ХА, хијалуронска киселина;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција;РРТ, релативно време задржавања;тР, време задржавања.
Да би се искључила могућност да нови уочени пикови могу бити загађивачи који су првобитно присутни у коришћеним сировинама, ове сировине су такође анализиране коришћењем исте методе ЛЦ-МС анализе.Анализирани почетни материјали укључују воду, 2% НаХА у води, 1% НаОХ у води и БДДЕ у истој концентрацији која се користи у реакцији унакрсног повезивања.Јонски хроматограм коришћеног почетног материјала није показао никакво једињење или пик, а његово време задржавања одговара новом уоченом пику.Ова чињеница одбацује идеју да не само да почетни материјал може садржати било каква једињења или супстанце које могу да ометају процедуру анализе, већ нема знакова могуће унакрсне контаминације са другим лабораторијским производима.Вредности концентрације добијене након ЛЦ-МС анализе БДДЕ и нових пикова су приказане у табели 2 (узорци 1-4) и јонски хроматограм на слици 4.
Напомена: Узорци 1-4 одговарају сировинама које се користе за производњу аутоклавираних БДДЕ умрежених ХА хидрогелова.Ови узорци нису аутоклавирани.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ХА, хијалуронска киселина;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција.
Слика 4 одговара ЛЦ-МС хроматограму узорка сировог материјала који се користи у реакцији унакрсног повезивања ХА и БДДЕ.
Напомена: Све ово се мери у истој концентрацији и односу који се користи за спровођење реакције унакрсног повезивања.Бројеви за сировине анализиране хроматограмом одговарају: (1) води, (2) 2% воденом раствору ХА, (3) 1% воденом раствору НаОХ.ЛЦ-МС анализа је изведена за конверзију масе од 203,30/129,10 Да (у позитивном МРМ режиму).
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ХА, хијалуронска киселина;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција.
Проучавани су услови који су довели до формирања нових пикова.Да би се проучило како реакциони услови који се користе за производњу умреженог ХА хидрогела утичу на реактивност агенса за умрежавање БДДЕ, што доводи до формирања нових пикова (могућих нуспроизвода), извршена су различита мерења.У овим одређивањима проучавали смо и анализирали финални БДДЕ умреживач, који је третиран различитим концентрацијама НаОХ (0%, 1%, 0,1% и 0,01%) у воденом медијуму, праћено или без аутоклавирања.Процедура бактерија за симулацију истих услова је иста као и метода која се користи за производњу умреженог ХА хидрогела.Као што је описано у одељку „Материјали и методе“, транзиција масе узорка је анализирана помоћу ЛЦ-МС на 203,30/129,10 Да.Израчунати су БДДЕ и концентрација новог пика, а резултати су приказани у табели 3. У узорцима који нису аутоклавирани нису откривени нови пикови, без обзира на присуство НаОХ у раствору (узорци 1-4, табела 3).За узорке у аутоклаву, нови пикови се детектују само у присуству НаОХ у раствору, а чини се да формирање пика зависи од концентрације НаОХ у раствору (узорци 5-8, Табела 3) (РРТ = 0,79).Слика 5 приказује пример јонског хроматограма, који приказује два аутоклавирана узорка у присуству или одсуству НАОХ.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција.
Напомена: Горњи хроматограм: Узорак је третиран са 0,1% воденим раствором НаОХ и аутоклавиран (120°Ц током 20 минута).Доњи хроматограм: Узорак није третиран НаОХ, већ аутоклавиран под истим условима.Конверзија масе 203,30/129,10 Да (у позитивном МРМ моду) је анализирана помоћу ЛЦ-МС.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција.
У свим аутоклавираним узорцима, са или без НаОХ, концентрација БДДЕ је значајно смањена (до 16,6 пута) (узорци 5-8, табела 2).Смањење концентрације БДДЕ може бити последица чињенице да на високим температурама вода може деловати као база (нуклеофил) да отвори епоксидни прстен БДДЕ и формира једињење 1,2-диола.Моноизотопски квалитет овог једињења се разликује од квалитета БДДЕ и стога неће бити погођен.ЛЦ-МС је детектовао померање масе од 203,30/129,10 Да.
Коначно, ови експерименти показују да стварање нових пикова зависи од присуства БДДЕ, НАОХ и процеса аутоклавирања, али нема никакве везе са ХА.
Нови пик пронађен у времену задржавања од приближно 2,71 минута је затим окарактерисан ЛЦ-МС.У ту сврху, БДДЕ (9,9 мг/мЛ) је инкубиран у 1% воденом раствору НаОХ и аутоклавиран.У табели 4, карактеристике новог пика су упоређене са познатим референтним пиком БДДЕ (време задржавања приближно 3,47 минута).На основу анализе јонске фрагментације два пика, може се закључити да пик са временом задржавања од 2,72 минута показује исте фрагменте као и БДДЕ пик, али различитог интензитета (слика 6).За пик који одговара времену задржавања (ПИС) од 2,72 минута, примећен је интензивнији пик након фрагментације при маси од 147 Да.При концентрацији БДДЕ (9,9 мг/мЛ) коришћеној у овом одређивању, различити модови апсорпције (УВ, λ=200 нм) у ултраљубичастом спектру су такође уочени након хроматографског одвајања (слика 7).Пик са ретенционим временом од 2,71 минута је и даље видљив на 200 нм, док се БДДЕ пик не може уочити на хроматограму под истим условима.
Табела 4 Резултати карактеризације новог пика са временом задржавања од око 2,71 минута и БДДЕ пика са временом задржавања од 3,47 минута
Напомена: Да би се добили ови резултати, обављене су ЛЦ-МС и ХПЛЦ анализе (МРМ и ПИС) на два пика.За ХПЛЦ анализу користи се УВ детекција са таласном дужином од 200 нм.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ХПЛЦ, течна хроматографија високих перформанси;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција;м/з, однос масе и наелектрисања;ПИС, јонско скенирање производа;ултраљубичасто светло, ултраљубичасто светло.
Напомена: Фрагменти масе су добијени ЛЦ-МС анализом (ПИС).Горњи хроматограм: масени спектар фрагмената БДДЕ стандардног узорка.Доњи хроматограм: Детектовани масени спектар новог пика (РРТ повезан са БДДЕ пиком је 0,79).БДДЕ је обрађен у 1% раствору НаОХ и аутоклавиран.
Скраћенице: БДДЕ, 1,4-бутандиол диглицидил етар;ЛЦ-МС, течна хроматографија и масена спектрометрија;МРМ, праћење вишеструких реакција;ПИС, јонско скенирање производа;РРТ, релативно време задржавања.
Слика 7. Јонски хроматограм јона прекурсора од 203,30 Да, и (А) нови пик са временом задржавања од 2,71 минута и (Б) УВ детекција референтног стандардног пика БДДЕ на 3,46 минута на 200 нм.
У свим произведеним умреженим ХА хидрогеловима, примећено је да је резидуална концентрација БДДЕ након ЛЦ-МС квантификације била <2 ппм, али се у анализи појавио нови непознати пик.Овај нови врх не одговара стандардном производу БДДЕ.БДДЕ стандардни производ је такође прошао исту конверзију квалитета (МРМ конверзија 203,30/129,10 Да) анализу у позитивном МРМ режиму.Генерално, друге аналитичке методе као што је хроматографија се користе као гранични тестови за откривање БДДЕ у хидрогеловима, али максимална граница детекције (ЛОД) је нешто нижа од 2 ппм.С друге стране, до сада су НМР и МС коришћени за карактеризацију степена унакрсног повезивања и/или модификације ХА у фрагментима јединица шећера умрежених ХА производа.Сврха ових техника никада није била да се квантификује детекција резидуалног БДДЕ при тако ниским концентрацијама као што смо описали у овом чланку (ЛОД наше ЛЦ-МС методе = 10 ппб).
Време поста: 01.09.2021